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      創新前沿賽默飛助力生物醫藥行業解決HCPs分析難題

      發布:賽默飛世爾科技(中國)有限公司
      瀏覽次數:189

      生物醫藥行業的技術盛會

      7月17-19日,由中國藥學會主辦的“第七屆中國藥學會生物技術藥物質量分析研討會”盛大召開,來自生物醫藥及科研領域的多位專家及現場近300位行業人士相聚夏日炎炎的北京,共同探討生物醫藥行業內的研究進展及前沿技術。

      賽默飛色譜質譜生物制藥業務發展經理唐愷帶來《基于高分辨質譜平臺的宿主細胞殘留蛋白(HCPs)檢測》的解決方案,助力生物醫藥行業解決HCPs分析難題。

      賽默飛色譜質譜生物制藥業務發展經理唐愷

       

      什么是HCPs?為什么需要關注HCPs?

      重組蛋白類藥物是由遺傳修飾的原核或真核宿主細胞培養/發酵產生,由于細胞凋亡/死亡/裂解,其他非必需蛋白質也可能釋放到細胞培養基/發酵液中,因此殘留在終產品中的其他蛋白質即為宿主細胞殘留蛋白(HCPs)

       

      HCPs的存在會影響藥物的安全性和有效性,以及具有蛋白水解活性的HCPs影響藥物產品的穩定性,因此生物醫藥公司不斷優化其純化工藝,從而控制終產品中HCPs的種類和含量

       

      現有分析方法有哪些不足?

      目前ELISA方法因其高靈敏度、高通量和易操作優勢成為工業界的金標準,但仍存在很多限制。包括:

      1.不能對HCPs進行精準鑒定,低豐度HCPs的檢測易受限于高豐度蛋白的干擾;

      2.定量動態范圍(3個數量級)較低,抗體受限,開發周期長;

      3.無法改變已有的方法,缺少校正標準限制定量的準確性,因此需多種檢測方法相結合。

       

      高分辨質譜技術的優勢

      隨著高分辨質譜技術性能的不斷提升,已具有高靈敏度和寬的定量動態范圍,以及蛋白質組學技術的飛速發展,可實現對未知蛋白質的高通量定性和定量。

      Thermo Scientific? Q Exactive? Plus

      組合型四極桿Orbitrap質譜儀

       

      基于nanoLC-MS/MS高靈敏平臺的方法,如何對HCPs進行準確定性和相對定量呢?

      一、樣品前處理

      2017年禮來制藥公司Huang, Lihua, et al.在Analytical Chemistry雜志上發表中的方法是,以NIST抗體標準品為例,在蛋白質非變性的條件下進行酶切,抗體主成分被部分酶切,酶切后經90度高溫變性,未被酶切的部分將被沉淀去除,從而提高HCPs的鑒定幾率和方法的動態范圍。

       

      我們在此基礎上進一步優化,縮短前處理時間提高工作效率,同時為考察此套流程對1-100ppm的HCPs的鑒定和相對定量能力,加入內標蛋白UPS2(48種蛋白,6個不同濃度)進行定性和相對定量。

      圖1.樣品前處理流程示意圖(來自Huang, Lihua, et al.)

       

      二、儀器、色譜柱、數據分析軟件

      目前根據液相色譜的流速可分為納升液相色譜(nanoLC,<1μL/min)、毛細管液相色譜(capillaryLC,1-1μL/min)、微流速液相色譜(microLC,10-100μL/min)、分析流速液相色譜(LC,>100μL/min),由于樣品單位濃度和離子化效率依次下降,因此其靈敏度逐漸下降,本次實驗采用靈敏度最高的納升液相系統。

       

      三、實驗結果

      1.定性結果:

      內標蛋白UPS2中含有48種內標蛋白6個不同濃度,共鑒定其中24種,其實際含量結果如表1,含量范圍為0.05-444.88ppm,實際含量>1ng(10ppm)的16種內標蛋白全部鑒定到,實際含量在0.06-0.38ng(0.6-3.8ppm)范圍內共鑒定到6種,此方案的靈敏度足以滿足生物藥領域客戶的需求。

      (詳細結果請見文末AN下載)

      表1.本次實驗中鑒定到UPS2內標蛋白的種類及其實際含量

       

      2.蛋白相對定量結果:

      本次實驗進行HCPs的相對定量,采用蛋白TOP3的特異性肽段峰面積的平均值算法,得出每種蛋白的峰面積,經過三次技術重復,對特異性肽段大于等于1的蛋白峰面積進行統計,平均峰面積分布如圖3A,峰面積大于1e?的蛋白為此樣品的主抗體,可看出本實驗定量范圍達6個數量級。UPS2內標蛋白的峰面積與絕對含量的分布如圖3B,峰面積與絕對含量存在一定的線性關系, HCPs的相對含量可根據其峰面積進行初步判斷,進而優化純化工藝。

      圖3A.特異性肽段大于等于1的蛋白峰面積分布圖

      圖3B.內標蛋白UPS2的峰面積(log2)與其絕對含量的分布

       

      基于UHPLC-MS/MS平臺的方法:

      UHPLC-MS/MS對于低含量HCPs的檢測時,需提高上樣量(至少是納升液相系統的50倍)以提高其靈敏度。

      經實例驗證此方法同樣滿足當前大部分需求,某抗體藥物的HCPs經ELISA定量為5ppm,UHPLC-MS/MS能夠準確鑒定到6種HCPs(unique peptides≥2),通過內標UPS2確定其檢測限達1ppm,6種HCPs的相對含量在1-10ppm內。

       

      小結

      隨著蛋白質組學的飛速發展,賽默飛Orbitrap高分辨質譜,可采用納升液相,超高效液相兩種方式,定性和相對定量分析HCPs,LOD均低至1ppm以下,為傳統的ELISA方法補充更為豐富的信息,進一步幫助生物醫藥企業優化純化工藝,監控終產品和過程產物中的HCPs含量。

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      2019-07-22 10:41:51
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