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      蛋白質的分離純化的步驟

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      通常,對某一特定蛋白質的分離純化的步驟包括前處理、粗分級、細分級三步,下面就讓小編帶你了解一下。


      前處理:

      對于某種蛋白質的分離純化,首先需要通過溶解的狀態從原來的組織或細胞中釋放出蛋白質并且使原來的天然狀態保持不變,從而使生物活性不丟失生。之后,按照不同的情況,選擇適當的方法,破碎掉組織和細胞。可以使用電動搗碎機或勻漿機破碎或超聲波對動物組織和細胞進行處理破碎。

      如果所要的蛋白主要在如細胞核、染色體、核糖體或可溶性細胞質等某一細胞組分集中,那么可以通過差速離心的方法分開它們,對該細胞組分進行收集以作下步純化的材料。如果所要蛋白是與細胞膜或膜質細胞器結合的,那么必須使用超聲波或去污劑解聚膜結構,然后使用適當介質來提取。


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      粗分離

      當獲得蛋白質提取液(有時還雜有核酸、多糖之類)以后,選擇合適的方法來分離所要的蛋白與其他雜蛋白。通常使用鹽析、等電點沉淀和有機溶劑分級分離等方法來進行這一步的分離。這些方法不但操作簡單,而且能夠處理很多,既可以將大量的雜質除去,又可以使蛋白溶液濃縮。一些蛋白提取液體積比較打,使用沉淀或鹽析法濃縮又不適用,那么進行濃縮的方法可以是超過濾、凝膠過濾、冷凍真空干燥或其他方法。


      細分離

      樣品在進行粗分級分離以后,通常只有很小的體積,以及去除了絕大多數的雜蛋白大部分。通常使用包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等層析法來進行進一步純化。作為最后的純化步驟選擇包括區帶電泳、等電點聚焦等電泳法也很有必要。蛋白質分離純化的最后步驟結晶,結晶過程不能夠使蛋白一定是均一得到確保,然而只有在溶液中某種蛋白在數量上占有優勢時才能有結晶形成。


      離子層析法

      當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時,會在離子交換劑上吸附帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質,之后通過對pH進行改變等方法洗脫吸附的蛋白質。


      有機溶劑提取

      與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)可以顯著降低一些蛋白質在水中的溶解度,并且在一定的離子強度、溫度以及PH值下,導致蛋白質沉淀的有機溶劑的濃度不一樣,所以蛋白質的分離純化能夠通過對有機溶劑的濃度的控制來實現。在室溫下,有機溶劑不但能夠導致蛋白質的沉淀,而且會變性。所以,一般需要首先冷卻,有機溶劑,之后為了避免局部濃度過高,不斷攪拌并且將有機溶劑加入。能夠在很大程度上解決蛋白質的變性問題。


      2019-08-02 17:01:45 瀏覽次數:91次
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